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qPCR实验结果孬？Takara帮你补补脑

一、首先要注意防污染，实验室如果是进行病毒病原菌的检测的话，防污染更是重中之重的一个事项，在整个的操作过程中都要避免产生各类污染。

① 实验室应尽量进行严格的分区，包括RNA提取的区域，反应液配置区，模板添加区。那么在反应液配置区，一定不要有核酸的出现，RNA的提取和模板添加的操作最好在生物安全柜中进行。相应的设备、器具、试剂和耗材等都要分区来使用。
② 在进行加样的时候，枪头盒必须要保持关闭的状态，也不可以在吸完阳性对照之后经过打开的枪头盒上方，这些都是可能会引起污染的。
③ 在加样顺序方面，应在反应液配置区添加阴性对照并盖好盖子后，再拿到模板添加区加入待检核酸，最后再加阳性对照。
防污染为什么如此重要呢，因为qPCR是一种灵敏度非常高的实验技术，一旦有污染出现之后进行去除是非常困难非常麻烦的，所以一定要注意防污染操作。

二、在试剂的使用方面需要注意，我们使用的试剂大部分都是预混型的，为了保护试剂中的酶通常还会加入甘油等粘度较大的物质，试剂使用前一定要在冰上完全融化并且混匀后再使用，有的老师因为没有将试剂混匀而导致实验结果不佳，白白浪费了很多时间。

【在2023年Takara推出了多款全新的qPCR相关试剂：染料法qPCR试剂——CN830、定量专用反转录试剂——RR092和探针法qPCR试剂——RR393都是预混型的试剂，一定要完全混匀之后再进行使用】
划重点，混匀方法各有不同，要注意啊！
混匀时要注意轻柔的混匀，不要使用振荡器，因为试剂中含有酶，使用振荡器剧烈混匀的话可能会导致酶活下降。
如果是体积比较小，不超过100 μl的组分，用手轻弹管底就可以了，对于体积大一些的组分，可以采用边颠倒边轻弹的方式混匀。下面我们来通过视频来看一下具体如何操作。

①首先是体积不超过100 μl的组分，可以用手轻弹管底，使液面上下浮动，要尽量避免起泡，再使用桌面小离心机进行瞬时离心。

②体积较多的超过100μl的组分，采用边颠倒边轻弹的方式混匀，也要注意尽量避免产生气泡，颠倒10次左右，再使用桌面小离心机瞬时离心。

③在进行模板稀释的时候也应该采用轻弹离心的方式进行混匀。

【进行模板稀释的时候推荐使用Takara的EASY Dilution II（Code No. 9451），如果用灭菌水或TE Buffer稀释模板DNA或RNA，由于受离心管的吸附作用等原因的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果准确度下降。】

三、最后一个需要注意的方面呢，是要在实验操作中保持良好的操作习惯，这样可以减少平行样之间的操作误差。

①可以通过先配置预混液分装再加入模板的方式减少误差。配置预混液时需要先加入体积最大且最稳定的组分——通常是水，而体积最小且最不稳定的组分需要最后加入——常常是酶，预混液也要记得进行颠倒混匀或者使用移液器吸打混匀之后再进行分装。
②一些试剂或者模板/引物的加入量很少，移液器是否准确也是一个关键问题，一个很小的误差经过指数放大之后就会变得明显，对Ct值的影响还是非常大的，而且平行样之间如果差距比较大，和移液器是否正确使用、有没有定期校正都是有关系的。

相关产品介绍

☆ 定量PCR专用稀释液

注：9451与9160在性能上没有明显区别，但9451可以与更多的PCR试剂和反转录反应试剂一起使用，然而我们并没有确认其与所有试剂的兼容性，请以实际实验结果为准。

实验例

分别使用 EASY Dilution II（for Real Time PCR）（Code No. 9451）和 TE Buffer（10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，pH 8.0）对模板（转录的RNA，Lambda imm434 bacteriophage）进行稀释，并以它们为模板使用TB Green^® Premix Ex Taq^™ II (Tli RNaseH Plus)（RR820）进行实时定量PCR反应。比较结果如下：